ПГУ буюу полимеразын гинжин урвал нь анагаах ухаан болон бусад шинжлэх ухааны салбарт өргөн хэрэглэгддэг лабораторийн нарийн төвөгтэй арга юм. Нэгэн цагт ПГУ-ын оношлогоо нь шинжлэх ухаанд жинхэнэ нээлт болсон.
Тодорхойлолт
Тоон ПГУ нь бодит цагийн ПГУ-ын нэг төрөл юм.
Энэ нь урвалын кинетикийг байнга бүртгэдэг ПГУ-ын хувилбар гэж ойлгогддог бөгөөд энэ нь нарийн төвөгтэй молекул хольц дахь ДНХ-ийн нуклеотидын тодорхой дарааллын агуулгыг чанарын хувьд үнэлэх боломжтой болгодог.
Тоон ПГУ-ын аргыг доор дэлгэрэнгүй авч үзэх болно.
Шинжилгээний мөн чанар
Соёлын болон ийлдэс судлалын аргуудыг ялангуяа халдварыг оношлоход ихэвчлэн ашигладаг. Эхнийх нь цусны ийлдэс дэх халдварт эмгэг төрүүлэгчийн эсрэгбиемүүдийг тодорхойлдог. Хоёрдугаарт, өвчтэй хүнээс авсан биологийн материалыг эмгэг төрүүлэгч колонийн өсөлтөд таатай тусгай тэжээлт бодисыг тарихад ашигладаг. Аль алинд нь оношлогоотохиолдол өдөр эсвэл долоо хоног үргэлжилж магадгүй.
ПГУ-ын шинжилгээг өвчтэй хүнээс авсан өөр өөр биологийн материалаар хийж болно. Цус болон бусад эмгэг, физиологи, биологийн орчин, шингэн нь дээжийн үүрэг гүйцэтгэдэг. Та ялгадас эсвэл шээсний ПГУ-г хийж болно.
Хэвийн бус ба вируст халдварыг ихэвчлэн тоон шинжилгээгээр оношилдог, учир нь тэдгээрийн үүсгэсэн эмгэг процессын өвөрмөц шинж чанараас шалтгаалан оношлоход амаргүй байдаг. Ийм халдварыг тодорхойлохын тулд ийлдэс судлалын аргаар тодорхойлогддог бие махбодид эсрэгбие үүсч эхэлдэг цаг хугацаа шаардагдана. Гэхдээ энэ нь зарим тохиолдолд хүлээн зөвшөөрөгдөхгүй.
Гүйцэтгэх арга
ПГУ-ын арга - өвчтөнөөс тусгаарлагдсан дээжинд халдварыг лабораторийн аргаар илрүүлэх (in vitro).
Полимеразын гинжин урвал явуулахын тулд тусгай урвалжийн багц шаардлагатай.
Туршилтын материалыг урвалж бүхий туршилтын хоолойд хийнэ. Туршилтын хоолойг тусгай төхөөрөмжид байрлуулсан - хүссэн РНХ эсвэл ДНХ-ийн хэсгүүдийг олшруулах (тоо нэмэгдүүлэх) зориулалттай ПГУ-ын өсгөгч, ПГУ-ын өсгөгч нь мөчлөгийн горимд ажилладаг. Аливаа мөчлөгийн үед дээж нь эмгэг төрүүлэгчийн РНХ эсвэл ДНХ-ийн дарааллыг агуулсан байвал уусмалд эдгээр нуклейн хүчлүүдийн тоосонцор улам бүр нэмэгддэг. Та дээжинд эмгэг төрүүлэгч байгаа эсэх, түүний хэмжээг тодорхойлох боломжтой.
ПГУ-ын төрлүүд
ПГУ-ын чанарын шинжилгээ нь дараах үр дүнг авах боломжийг олгоно:
- сонирхолтой эмгэг төрүүлэгч дээжинд илрээгүй үед сөрөг;
- Тухайн эмгэг төрүүлэгчийн шинж чанартай дээжинд дараалал илэрвэл эерэг байна.
ПГУ-ын эерэг үр дүн гарсан тохиолдолд бид оношлогдсон халдвар байгаа эсэхийг 95% нарийвчлалтай хэлж чадна. Үүний зэрэгцээ оношилгооны зорилгоор ашигладаг ПГУ-ын нарийвчлал 100% хүрдэг.
Буруу үр дүнгийн 5% нь хүний хүчин зүйлээр тодорхойлогддог. Жишээлбэл, урвалжийг шинжлэх, хадгалах техникийг зөрчих нь судалгааны нарийвчлалыг эрс бууруулдаг.
Тоон ПГУ нь вирусын ачааллын тухай ойлголтыг тодорхойлдог. Өвчтөнөөс авсан дээжинд хэдэн багц эмгэг төрүүлэгч ДНХ байгааг тодорхойлох боломжтой.
Халдварын хүнд байдал нь тэдний тооны өсөлттэй шууд пропорциональ байна. Та мөн вирусын ачааллыг бууруулах эмчилгээний амжилтыг тодорхойлох боломжтой.
ПГУ-ын биоматериал илгээх
Тоон ПГУ-ыг эмнэлэгт голчлон өглөө хийдэг. Эмчтэй уулзах үеэр өвчтөнд юу авах шаардлагатайг хэлж өгнө: хусах, т рхэц, шээс, цус. ПГУ нь материалын бохирдлын түвшингээс үл хамааран эмгэг төрүүлэгчийг илрүүлэх боломжтой.
Эерэг дүн шинжилгээ хийхийн тулд онолын хувьд дээжинд зөвхөн нэг эмгэг төрүүлэгч байх шаардлагатай. Практикт тэд илүү таатай нөхцлийг бүрдүүлэхийг хичээдэг. Үүнд зориулсан зарим зөвлөмжүүд байна:
- хэрэв тэд бэлэг эрхтнээс хусах юмуу арчдас авбалСудалгаанаас гурван өдрийн өмнө та бэлгийн харьцаанд орохоос татгалзах хэрэгтэй;
- шинжилгээ хийхээс өмнө бактерийн эсрэг эмээр угааж болохгүй;
- шээсний сүвнээс түрхэц авахаас 3 цагийн өмнө гэдэс хоослохгүй тэвчээртэй байх хэрэгтэй.
Цусаа өгөхдөө эдгээр дүрмийг бүү мөрд.
Тоон ПГУ-ын шинжилгээний үр дүнг хэрхэн тайлбарладаг вэ?
Голдсон үр дүнгийн тоон үнэлгээ
Эмнэлзүйн хэд хэдэн нөхцөл байдалд эмчилгээний үр дүн ба / эсвэл эмгэг судлалын үйл явцын динамикийн асуудал гарч ирдэг. Ийм асуултууд ялангуяа архаг халдвартай (хүний дархлал хомсдолын вирус, гепатит В, С) өвчтэй хүмүүсийг шалгаж үзэхэд чухал ач холбогдолтой юм. Оношлогоо хийхдээ тэдгээр нь amplicons (ПГУ-ын бүтээгдэхүүн) хуримтлал нь шинжилгээнд хамрагдсан дээжинд хүссэн генийн хуулбар байгаатай пропорциональ байдагт үндэслэдэг.
Мэдээжийн хэрэг, тоон ПГУ-ын үр дүнг харгалзан тусгай ПГУ-ын дохионы эрчмийг судлах замаар гель электрофорез хийдэг. Мөн олж авсан үр дүнг зөв тоон үнэлэх урьдчилсан нөхцөл бол хүссэн генийн мэдэгдэж буй тооны хуулбарыг агуулсан эерэг хяналтын дээж (жишээлбэл, нэг ПГУ-ын урвалын хувьд гепатит С генийн мянган хувь) юм. Тоон хяналтын хэд хэдэн цуваа шингэрүүлэлт нь шалгалт тохируулгын муруйг үүсгэх боломжийг олгодог бөгөөд үүнийг эмнэлзүйн сорьц дахь клиник генопопийн агуулгыг үнэлэхэд ашигладаг.
Тоон ПГУ-ын тодорхойлолтод гол ололт нь бий болсон явдал юмФлюресцент ДНХ мэдрэгч нь энгийн праймеруудтай зэрэгцэн урвалын холимогт нэмж, ПГУ-ын үйл явцыг цаг тухайд нь хянах боломжийг олгодог, өөрөөр хэлбэл бодит цагийн ПГУ.
TaqMan аргачлал нь ампликоны дунд хэсэгт хамаарах флюресцент ДНХ датчикуудын нийлэгжилтийг хэлдэг бөгөөд төгсгөлд нь хоёр шошготой байдаг. Тэдний нэг нь флюресцент шошго, хоёр дахь нь энэ флюресценцийг унтраах молекул юм.
Флюориметр ба термоблок өсгөгчийн эрлийз тусгай төхөөрөмж нь туршилтын хоолой бүрт флюресценцийн тогтмол хэмжилт хийдэг (бодит цагийн ПГУ-ын зарчим). ПГУ-ын 20-40 мөчлөгийн дараа дээж тус бүрээр тус тусад нь муруй гарна. Туршилтын дээжинд агуулагдах хүссэн генийн хуулбарын тоог хяналтын дээж бүхий тохируулгын муруйгаас тооцоолж болно.
Мөн ПГУ-ыг флюресцент аргаар хэрэгжүүлэх нэг чухал онцлог нь үр дүнг тооцохдоо ПГУ-ын хольцтой гуурс нээх шаардлагагүй юм. Энэ нь өрөөг олшруулах бүтээгдэхүүнээр бохирдуулах магадлалыг бууруулж, электрофорез хийхэд тусгай ажлын талбай хуваарилах шаардлагагүй болно.
Тоон ПГУ-ын транскрипт юуг харуулж байна вэ?
Юу илрүүлж байна вэ?
Тоон ПГУ гэх мэт аргын тусламжтайгаар генийн чанарын өөрчлөлтүүд олддог: оруулах, устгах, цэгийн мутаци. Гэхдээ зарим удамшлын эмгэгийн үед тодорхой генийн агууламж өөрчлөгдсөний хариуд холбогдох шинж тэмдгүүд илэрдэг.
БаярлалааТоон дүн шинжилгээ нь ихэвчлэн IU / мл-ээр тоон үр дүнг өгдөг. Энэ нь шинжилгээний дээжийн нэг миллилитрээс олон улсын нэгжээр хэмжсэн эмгэг төрүүлэгчийн РНХ эсвэл ДНХ-ийн тодорхой тооны хуулбар илэрсэн гэсэн үг.
Халдварын цар хүрээнээс хамаарч хүндийн зэрэг оношлогддог. Өвчний үед вирус цусанд чөлөөтэй хөдөлдөг тул вирусын ачааллыг тодорхойлохын тулд цусыг ихэвчлэн шинжилдэг.
Онцлогууд
Цусны шинжилгээний тоон ПГУ нь хоёр онцлогтой.
- Үйлдвэрлэсэн ПГУ-ын бүтээгдэхүүний агуулгыг үнэн зөв тодорхойлохын тулд флюресцент эсвэл цацраг идэвхт шошго бүхий праймерууд эсвэл дезоксирибонуклеозид трифосфатуудын оролцоотойгоор шинжилгээг хийнэ.
- ПГУ-ын процесст хэт олон ПГУ-ын бүтээгдэхүүн гарч ирэхээс өмнө урвалыг эрт дуусгана. Энэ нь ханалтын эцсийн шатанд ПГУ-ын бүтээгдэхүүн их байх үед фермент өөрөө болон субстратууд хоёулаа энэ урвалын хязгаарлагч холбоос болж ажилладагтай холбоотой юм. Ийм нөхцөлд ПГУ-ын дараагийн мөчлөгийн төгсгөл нь ПГУ-ын бүтээгдэхүүний тоо хоёр дахин ихэссэнээр тодорхойлогддоггүй, янз бүрийн дээжүүдийн хоорондын тоон ялгаа бага зэрэг жигдэрсэн бөгөөд энэ нь хэд хэдэн урвалын мөчлөгийг дамжуулсны дараа эхний үе шатанд нэлээд тодорхой тодорхойлогддог..
ПГУ-ын оношлогооны зардал
ПГУ-ын судалгаа нь ямар төрлийн халдвар, шинжилгээний аргачлал, шинжилгээний материал зэргээс шалтгаалах зардалтай байдаг. Нэг халдварыг тодорхойлохын тулд та дотор нь өгөх хэрэгтэй болно200-800 рубль. Биоматериал авах хураамж мөн нэмэгдсэн - ойролцоогоор 400 рубль.
