Хроматографи нь бодисыг ялгах аргуудын нэг юм. Энэ нь бичил хэсгүүдийн физик, химийн шинж чанарын дараачийн чанарын болон тоон шинжилгээнд ашиглагддаг. Энэ технологийн нэг хувилбар нь ойрын хроматограф юм. Молекулын хамаарлын шинж чанарыг ашиглан уургийн нэгдлүүдийг ялгах санаа нь шинжлэх ухаанд хэдэн арван жилийн турш мэдэгдэж байсан. Гэсэн хэдий ч энэ нь матриц болгон ашигладаг өндөр сүвэрхэг гидрофилик материалыг нэвтрүүлсний дараа л сүүлийн жилүүдэд хөгжиж эхэлсэн. Энэ арга нь аналитик (бодисыг ялгах, тодорхойлох) болон бэлдмэлийн (цэвэршүүлэх, баяжуулах) асуудлыг шийдвэрлэх боломжийг олгодог.
Эссенс
Афинитын хроматографи (Латин хэлний affinis - "зэргэлдээх", "холбоотой" гэсэн үгнээс гаралтай) нь холбогч молекул (лиганд эсвэл аффинант) болон зорилтот молекулын хооронд өндөр өвөрмөц холбоо үүсэх явдал болох ойрын харилцан үйлчлэлд суурилдаг. Эдгээр механизмууд нь байгальд өргөн тархсан байдаг (зуучлагч эсвэл гормон ба рецепторуудын холболт, эсрэгбие баэсрэгтөрөгч, полинуклеотидын гибридизаци болон бусад төрлийн процессууд). Анагаах ухаанд ойрын хроматографийг 1951 оноос хойш практик зорилгоор ашиглаж ирсэн
Бүрэлдэхүүн хэсгүүд нь дараах байдлаар хуваагдана:
- тусгаарлах бодис агуулсан ажлын уусмалыг сорбентоор дамжуулна;
- сорбентын матрицад хуримтлагдсан лиганд нь энэ бодисыг хадгалдаг;
- төвлөрсөн (хуримтлал);
- сорбентоос тусгаарлагдсан бодисыг уусгагчаар угаах замаар гаргаж авах.
Энэ арга нь бүхэл эсийг тусгаарлах боломжийг олгодог. Уламжлалт сорбцийн хроматографаас ялгаатай нь тусгаарлагдсан бүрэлдэхүүн хэсэг нь сорбенттой биологийн өвөрмөц холболттой байдаг бөгөөд энэ нь өндөр сонгомол шинж чанартай байдаг.
Шингээгч
Дараах бодисыг шингээгч болгон ашигладаг:
- Агараас гаргаж авсан полисахарид болох агароз дээр суурилсан гель нэгдлүүд. Хамгийн түгээмэл хэрэглэгддэг 3 сорт: сефароз 4В, CL (хөндлөн холбоост агароз) болон аффи-гель. Сүүлчийн найрлага нь агароз ба полиакриламидын өөрчлөгдсөн гель юм. Энэ нь биологийн идэвхгүй байдал, химийн болон дулааны өндөр эсэргүүцэлтэй.
- Цахиур (цахиурын гель).
- Шилэн.
- Органик полимер.
Лигандтай харьцах үед механик саад тотгорыг арилгахын тулд түүнийг тээвэрлэгчээс (пептид, диамин, полиамин, олигосахарид) салгахад нэмэлт бодис хэрэглэдэг.
Тоног төхөөрөмж
Афинитын хроматографийн төхөөрөмжид дараах үндсэн нэгжүүд орно:
- зөөврийн фазын агуулах сав (угаагч);
- дунд хангамжийн өндөр даралтын насос (ихэнхдээ поршентой);
- тоосноос ялгах бодисыг цэвэрлэх шүүлтүүр;
- тунг тогтоох төхөөрөмж;
- холимог ялгах хроматографийн багана;
- баганаас салсан бүрэлдэхүүн хэсгүүдийг илрүүлэх илрүүлэгч;
- хроматограм бичигч ба микропроцессорын нэгж (компьютер).
Ууссан агаарын хэмжээг багасгахын тулд гелийг эхлээд хөдөлгөөнт фазаар дамжуулдаг. Угаах шингэний концентрацийг өөрчлөхийн тулд програмистаар удирддаг хэд хэдэн насос суурилуулсан. Хроматографийн багана нь зэвэрдэггүй ган (зэврэлтэнд тэсвэртэй байх шаардлагад нийцүүлэн), шил (бүх нийтийн сонголт) эсвэл акрилаар хийгдсэн. Бэлтгэх зорилгоор тэдгээрийн диаметр нь 2-оос 70 см-ийн хооронд хэлбэлзэж болно. Аналитик хроматографид Ø10-150 мкм хэмжээтэй бичил багануудыг ашигладаг.
Итекторуудын мэдрэмжийг нэмэгдүүлэхийн тулд урвалжуудыг холимогт оруулдаг бөгөөд энэ нь хэт ягаан туяа эсвэл спектрийн харагдах бүсэд илүү их туяа шингээх бодис үүсэхэд хувь нэмэр оруулдаг.
Арга зүй
Шингэнтэй харьцах хроматографийн 2 үндсэн төрөл байдаг:
- Баганыг хөдөлгөөнгүй фазаар дүүргэж, дундуур нь хольцыг урсгалаар дамжуулдаг баганацэвэрлэгч. Даралт эсвэл таталцлын дор салах боломжтой.
- Нимгэн давхарга. Угаагч нь хялгасан судасны хүчний нөлөөгөөр хавтгай шингээгч давхаргын дагуу хөдөлдөг. Шингээгчийг шилэн хавтан, керамик эсвэл кварц саваа, металл тугалган цаасанд хэрэглэнэ.
Ажлын үндсэн үе шатууд:
- шингээгч бэлтгэх, зөөгч дээр лигандыг бэхлэх;
- салах хольцыг хроматографийн баганад өгөх;
- хөдөлгөөнт фазын ачаалал, бүрэлдэхүүн хэсгүүдийг лигандаар холбох;
- холбогдсон бодисыг тусгаарлахын тулд үе шатыг солино.
Очих газар
Афинитын хроматографийг дараах төрлийн бодисыг тусгаарлахад ашигладаг (ашигласан лигандын төрлийг хаалтанд заасан):
- ферментийн дарангуйлагч, субстрат ба кофактор (фермент)-ийн аналогууд;
- генетикийн харь шинж тэмдэг бүхий биоорганик бодис, вирус, эс (эсрэгбие);
- өндөр молекул жинтэй нүүрс ус, моносахаридын полимер, гликопротейн (лектин);
- цөмийн уураг, нуклеотидилтрансфераза (нуклейн хүчил);
- рецептор, тээвэрлэгч уураг (витамин, гормон);
- эсийн мембрантай (эсүүд) харилцан үйлчилдэг уураг.
Энэ технологийг мөн хөдөлгөөнгүй ферментийг гаргаж авахад ашигладаг бөгөөд тэдгээрийг целлюлозтой холбосноор дархлаа шингээх бодис үүсэх боломжтой.
ДНХ холбогч уургийн хроматографи
ДНХ холбогч уургийг тусгаарлах нь ашиглан хийгддэггепарин. Энэхүү гликозаминогликан нь олон төрлийн молекулуудыг холбох чадвартай. Энэ бүлгийн уургийн хамаарлын хроматографийг дараах бодисуудыг тусгаарлахад ашигладаг:
- орчуулгыг эхлүүлэх, сунгах хүчин зүйлүүд (нуклейн хүчлийн молекул ба уургийн нийлэгжилт);
- хязгаарлалтууд (хоёр судалтай ДНХ-ийн тодорхой дарааллыг таних ферментүүд);
- ДНХ-ийн лигаза ба полимеразууд (хоёр молекулыг нэгтгэж шинэ химийн холбоо үүсгэх ферментүүд ба ДНХ-ийн репликацид оролцдог);
- дархлаа болон үрэвслийн процесст чухал үүрэг гүйцэтгэдэг серин протеазын дарангуйлагчид;
- өсөлтийн хүчин зүйлс: фибробласт, Schwann, эндотелийн;
- эсийн гаднах матрицын уураг;
- дааврын рецептор;
- липопротейн.
Нэр төр
Энэ арга нь реактив нэгдлүүдийг (фермент ба том агрегатууд - вирус) тусгаарлах хамгийн өвөрмөц арга юм. Гэхдээ энэ нь зөвхөн биологийн идэвхт бодисыг тусгаарлахад хэрэглэгддэггүй.
Бага хэмжээгээр эсрэгбие илрүүлэх, полиаденилийн хүчлийн тоон үнэлгээ, дегидрогеназын молекулын массыг хурдан тодорхойлох, зарим бохирдуулагчийг зайлуулах, трипсиний идэвхгүй хэлбэрийг идэвхжүүлэх кинетик, хүний молекул бүтцийг судлах. интерферонууд - энэ нь ойр дотно байдлыг ашигласан судалгааны бүх жагсаалт биш юм хроматографи. Эмнэлэгт ашиглах нь түүний давуу талуудтай холбоотой, тухайлбал:
- Үр дүнтэй цэвэрлэх чадваруураг, полисахарид, нуклейн хүчил. Эдгээр нь физик, химийн шинж чанараараа ялимгүй ялгаатай бөгөөд гидролиз, денатураци болон бусад аргуудад ашигладаг бусад төрлийн эмчилгээний явцад идэвхигүй болдог.
- Бодисыг ялгах хурд, үйл явцын динамик шинж чанар.
- Диссоциацийн тогтмолыг тодорхойлохын тулд тусгай фермент цэвэршүүлэх, изоферментийн нэгэн төрлийн болгох шаардлагагүй.
- Өргөн хүрээний бодисыг ялгах чадвартай.
- Лигандын хэрэглээ бага.
- Бодисыг их хэмжээгээр ялгах боломж.
- Биологийн макромолекулуудыг холбох урвуу процесс.
Энэ аргыг бусадтай хослуулж, нэмэлт талбар (таталцал, цахилгаан соронзон) үүсгэх боломжтой. Энэ нь танд хроматографийн техникийн чадавхийг өргөжүүлэх боломжийг олгоно.
Ферментийн инженерчлэл
Энэ аргын ачаар биотехнологийн шинэ салбар болох ферментийн инженерчлэл идэвхтэй хөгжиж эхэлсэн.
Фермент тусгаарлах ойрын хроматограф нь дараах давуу талуудтай:
- богино хугацааны үр дүнд ферментийг их хэмжээгээр авах, үүний үр дүнд - үнэ буурах;
- ферментүүдийг хөдөлгөөнгүй болгох нь анагаах ухаан, үйлдвэрлэлд хэрэглэх цар хүрээг ихээхэн өргөжүүлж чадна;
- Уусдаггүй хатуу тулгууртай ферментүүдийн холбоо нь байгалийн болон физиологийн процесст чухал үүрэг гүйцэтгэдэг бичил орчны нөлөө, урвалын чиглэлийг судлах боломжийг олгодог.
